Nach der Vernichtung Vulkans und dem Angriff auf die Erde im vorherigen Film, treibt die Sternenflotte die Erforschung des Alls massiv voran. Die Sternenflotte entdeckt dabei Khans Schläferschiff, ein Relikt aus den Eugenischen Kriegen der Erde vor 300 Jahren, mit genetisch verbesserten Menschen in Stase an Bord. Alexander Marcus weckt nur Khan auf und verschleiert seinen Fund. Khan bekommt eine Tarnidentität als John Harrison.

Marcus benutzt die weiterhin in Stase befindliche Mannschaft als Druckmittel gegen ihn, damit er gemeinsam mit Sektion 31 neue Waffen und Strategien entwickelt. Er hilft beim geheimen Aufrüsten der Sternenflotte. Schließlich schafft Khan es jedoch seine Leute in Torpedos zu verstecken und verübt einen Anschlag auf ein Forschungslabor von Sektion 31.
Bei der anschließend angesetzten Sicherheitsbesprechung der Sternenflottenführung, verübt er einen erneuten Anschlag und tötet viele Offiziere der Admiralität, unter ihnen auch Kirks Mentor Pike. Pike hatte kurz zuvor das Kommando über die Enterprise zurückerhalten, da Kirk gegen die Oberste Direktive verstieß und zum Ersten Offizier herabgestuft wurde.

Nun da Pike tot ist, erbittet Kirk von Admiral Marcus das Kommando über die Enterprise zurück um John Harrison zu verfolgen, welcher nach Kronos geflüchtet ist. Marcus gestattet es und erzählt Kirk dabei von Sektion 31. Er übergibt Kirk neuartige Torpedos, welche von Sektion 31 entwickelt wurden. Scotty weigert sich die Torpedos an Bord zu nehmen und quittiert seinen Dienst, woraufhin Chekov zum neuen Chefingenieur wird.

Kurz vor Kronos versagt der Antrieb der Enterprise, manipuliert von Sektion 31. Kirk führt daraufhin ein Außenteam auf den Planeten und nimmt Khan in Gewahrsam, der sich ergibt, sobald er erfährt, dass die Torpedos an Bord sind. Zurück auf der Enterprise gibt Khan seine wahre Identität preis und gibt Kirk einen Satz Koordinaten. Kirk ruft Scotty auf der Erde, entschuldigt sich, woraufhin er aufbricht und die Koordinaten überprüft. Bei den Zielkoordinaten stößt er auf ein im Geheimen von Sektion 31 gebautes Kriegsschiff.

Pille und Dr. Marcus finden währenddessen heraus, dass in den Torpedos Stasekammern versteckt sind. Khan bestätigt, dass es sich dabei um seine Mannschaft handelt, die er auf diesem Wege von der Erde schmuggelte. Als die Enterprise von der Gefangennahme berichtet, taucht das imposante Kriegsschiff von Sektion 31 auf. Die Enterprise versucht zu flüchten, doch mit beschädigtem Antrieb und dem überlegenen Verfolger schafft sie es nicht ganz bis zur Erde. In einem ungleichen Kampf wird die Enterprise fast vernichtet und nur durch den an Bord befindlichen Scotty, schaffen Kirk und Khan es in einer Feuerpause auf das Kriegsschiff zu gelangen. Dort stoppen sie die Crew um Admiral Marcus, ehe Khan die Kontrolle an sich reißt. Schließlich will er mit dem Schiff die Enterprise auslöschen und sich erneut zum Herrscher machen. Er erpresst gegen das Leben des Captains, die Torpedos mit den Stasekammern seiner Mannschaft, doch Spock hintergeht ihn, indem er die Stasekammern vorher entfernt und die Torpedos nach dem herüberbeamen zündet.

Während die Enterprise von dem Kampf schwer beschädigt in die Erdatmosphäre stürzt, rettet Kirk Crew und Schiff, indem er sein Leben im Reaktorraum opfert um den Antrieb wiederherzustellen. Währenddessen stürzt Khan mit seinem Schiff auf San Francisco, überlebt dies jedoch und kann erst von Spock und Uhura aufgehalten werden. Pille hat währenddessen herausgefunden, dass man mit Khans Blut ein Heilmittel für Kirk herstellen kann und so wird der Captain, nach zwei Wochen die er mit dem Tod rang, von den tödlichen Strahlenschäden geheilt.

Khan wird erneut in Stase versetzt und es dauert ein Jahr, bis die Schäden an der Enterprise behoben sind. Doch dann startet die Enterprise, mit angestammten Chefingenieur und Carol Marcus als zusätzlichen Wissenschaftsoffizier auf ihre erste 5-Jahres-Mission.

Hinter den Kulissen

• Die Identität Khans wurde lange Zeit verheimlicht, er wurde immer nur mit seiner Tarnidentität John Harrison genannt.
• Der Deutschlandstart fand genau vier Jahre nach dem Vorgänger statt, am 9.5.2013
• Einige Ungereimtheiten des Films werden im Nachfolger Beyond komplett ignoriert, wie zum Beispiel das Beamen von Planet zu Planet oder Khans Blut als Heilmittel. Zwar werden die Ereignisse nicht negiert, jedoch einfach nicht weiter erwähnt.
• Das Comic "Star Trek - Countdown to Darkness" zeigt die Vorgeschichte zum Kinofilm, bei der Kirk auf die Schmugglerin Mudd trifft und ihr Schiff beschlagnahmt, welches später im Film genutzt wird. Zudem erfährt man, dass Admiral Marcus früher ebenfalls auf einer Enterprise gedient hat, welche die Vorgängerin von Kirks Schiff war.